利用發(fā)光細(xì)菌檢驗(yàn)水中有毒有害物質(zhì)
一、發(fā)光細(xì)菌的存在，分離，純化和培養(yǎng)
廣闊的海洋是發(fā)光細(xì)菌生活的大本營(yíng)，從近海沿岸到南北極；從海水表面到深達(dá)1000米的海底都可找到發(fā)光細(xì)菌，只有少數(shù)生活在淡水湖泊河流中；有的寄生于各種海洋動(dòng)物如海魚(yú)的發(fā)光器官中；有的獨(dú)立生活在海水中，其數(shù)量依外界條件的變化而異，據(jù)測(cè)定夏秋季的海水中每毫升多達(dá)幾十到幾百個(gè)，發(fā)光細(xì)菌屬于腸道菌屬，分為十個(gè)種四個(gè)屬，在我國(guó)海洋中也陸續(xù)分離到十個(gè)種的六種，其中包括我國(guó)特有的新種。
發(fā)光細(xì)菌可以直接從海水中和海魚(yú)的體表和內(nèi)臟中分離，所采用的培養(yǎng)基為：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCI3%，瓊脂2%，pH6.5。高壓滅菌后制成平板，將海魚(yú)或無(wú)脊椎動(dòng)物（如烏賊）切成3～4cm大小小塊，或取其內(nèi)臟放入滅菌培養(yǎng)皿中20℃培養(yǎng)12－18小時(shí)，在暗室中尋發(fā)光點(diǎn)，用接種環(huán)挑取發(fā)光點(diǎn)，在營(yíng)養(yǎng)平板上，線培養(yǎng)后形成單個(gè)發(fā)光菌，再挑取單菌落反復(fù)劃線分離幾次，即可得到純化的發(fā)光菌株，將純化的菌株接種入同樣成分的斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)12小時(shí)后，在4℃下保存，每月轉(zhuǎn)接一次，可長(zhǎng)期保存活力，使用前接種到液體培養(yǎng)基中20℃下振蕩培養(yǎng)10－12小時(shí)，用磷酸緩沖液稀釋后備用。
國(guó)內(nèi)外一般都用明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium Phospholcum)作有毒有害物的檢驗(yàn)，上海華東師范大學(xué)已將此菌種制成干燥粉劑-20℃下可長(zhǎng)期保存，使用極為方便。
二、發(fā)光菌的發(fā)光機(jī)理
微生物在氧化代謝或呼吸作用過(guò)程中得到能量，呼吸作用等于生物的氧化作用，好氣性細(xì)菌具有細(xì)胞色素氧化還原酶系統(tǒng)，由于好氣性細(xì)菌的細(xì)胞色素可以作為氫的最終受體而利用空氣中的氧，底物的氫傳遞到NAD（煙酰胺腺嘌呤核苷酸）的脫氫酶的輔基上，結(jié)果形成還原型的AAD-H2，它可以將氫傳遞給黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，后者轉(zhuǎn)化為FAD- H2，就可以傳遞給細(xì)胞色素，能量以ATP（三磷酸腺苷）的形式釋放。
發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光過(guò)程是一種光呼吸過(guò)程，是上述電子傳遞鏈上的一個(gè)側(cè)支，還原型的黃素單核苷酸，F(xiàn)MNH2充當(dāng)反應(yīng)的底物，螢光酶起催化作用，長(zhǎng)鏈脂肪醛起作改變螢光酶構(gòu)造的“修飾”作用。螢光酶通過(guò)分子氧催化FMNH2和脂肪醛(RCHO)的氧化，這種氧化還原反應(yīng)結(jié)果便產(chǎn)生磷光(465～490nm之間較多)。外界條件和培養(yǎng)基成分pH，溫度，氧濃度變化會(huì)影響細(xì)菌的發(fā)光，而有毒的化學(xué)物質(zhì)，重金屬離子，抗生素，化學(xué)治療劑，農(nóng)藥等同樣會(huì)影響細(xì)菌發(fā)光，故采用發(fā)光細(xì)菌作為敏感的指標(biāo)物測(cè)定有毒有害物是可能的。
三、發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有毒有害的方法
1.儀器：SHG-1型生物化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x（上海市技術(shù)監(jiān)督局實(shí)驗(yàn)工廠產(chǎn)品）或Microtox 2055型毒物分析系統(tǒng)（美國(guó)MICROBICS CORPORATION產(chǎn)品）
2.培養(yǎng)基
(1)液體培養(yǎng)基：酵母膏5g，胰蛋白胨5g，NaCI40g，Na2HPO45g，KH2PO4lg，甘油3g，蒸餾水1000ml，pH6.5。
(2)固體培養(yǎng)基：上述液體培養(yǎng)基成份加2%瓊脂即可。
(3)稀釋用磷酸緩沖液：Na2HPO45g，KH2PO4lg，NaCI30g，蒸餾水100ml，pH6.5。
3.水樣濃縮
作某化學(xué)物質(zhì)的試驗(yàn)只需配制一定濃度的溶液即可，進(jìn)行水樣中有毒有害物質(zhì)的試驗(yàn)則需事先進(jìn)行水樣中毒害物的吸附，洗脫和濃縮。
取一定體積水樣V升（視水質(zhì)而定），用大孔樹(shù)脂(XAD系列事先分別經(jīng)甲醇、乙腈、丙酮回流8小時(shí)后保存于甲醇中)，用重蒸乙醚洗脫，濃縮至殘?jiān)?ml重蒸過(guò)的二甲亞砜溶解之。
1ml≈1V升水樣0.1ml≈0.1V升水樣
4.測(cè)定步驟
(1)菌體活化：裝置為0.5ml干燥菌劑，開(kāi)封后注入2～3ml冷的稀釋液，在旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩2～3分鐘，20℃平衡5～10分鐘，使其活化，待發(fā)光穩(wěn)定后即為活化菌懸浮液，置4℃下備用（活化后一天可用）。
(2)菌液處理：吸取不同體積（視水質(zhì)而定）二甲亞砜水樣濃縮液，分別在試管中用無(wú)菌蒸餾水稀至1ml，加入1ml緩沖液，然后再加入0.1ml菌懸浮液，搖勻，在一定溫度下(20±1℃)反應(yīng)10分鐘。并同時(shí)以二甲亞砜作對(duì)照試驗(yàn)。
3)用SAG-1型發(fā)光測(cè)量?jī)x測(cè)定光強(qiáng)度。
4)活菌計(jì)數(shù)
在測(cè)定光強(qiáng)度的同時(shí)用上述加有菌懸浮液的稀釋液稀釋涂布營(yíng)養(yǎng)平板，23℃培養(yǎng)12～16小時(shí)，計(jì)算活菌數(shù)。
5)結(jié)果計(jì)算：
相對(duì)抑光率=對(duì)照管光強(qiáng)－樣品管光強(qiáng)／對(duì)照管光強(qiáng)×100%
細(xì)菌死亡率=對(duì)照活菌數(shù)－樣品組活菌數(shù)／對(duì)照組合菌數(shù)×100%
對(duì)于單一化學(xué)物質(zhì)當(dāng)達(dá)到抑光率為50%時(shí)的濃度用EC50表示，目前已有大量的有機(jī)物測(cè)得了其EC50值。
對(duì)于水樣試驗(yàn)結(jié)果只能用水樣體積表示，EV50即表示抑光率為50%時(shí)所相對(duì)應(yīng)的水樣體積。
5.試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
對(duì)于某個(gè)水樣品可根據(jù)EC50評(píng)價(jià)其毒性的有無(wú)，按照25%的準(zhǔn)則，當(dāng)某個(gè)水樣品的EC50≦25%時(shí)可記為有毒，按50%準(zhǔn)則，某個(gè)水樣的EC50≦50%可記為有毒，還有一些其它分級(jí)方法。如何用發(fā)光細(xì)菌的檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)水質(zhì)進(jìn)行分類是一個(gè)有待研究的問(wèn)題，目前只能用以在相同條件下比較不同水樣的毒性，即加入同一水樣體積后測(cè)定其抑光率，抑光率大小評(píng)價(jià)其毒性；或者測(cè)得其EV50，依EV50的大小評(píng)價(jià)其毒性。
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