淺談混合培養(yǎng)微生物好氧降解對(duì)硝基苯胺的特性研究
摘要：本文以對(duì)硝基苯胺為目標(biāo)污染物，通過(guò)富集培養(yǎng)某化工廠好氧處理池的污泥，獲得了對(duì)該污染物降解效果較好的混合培養(yǎng)微生物。用該微生物作為降解菌源，對(duì)對(duì)硝基苯胺的生物降解特性進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究。
1.前言
硝基苯胺（NA）的三種異構(gòu)體：鄰硝基苯胺、間硝基苯胺、對(duì)硝基苯胺，是印染、橡膠、制藥、塑料和油漆等行業(yè)的重要原料，是染料工業(yè)的中間體。這3種化合物可通過(guò)呼吸道、消化道而攝入體內(nèi),使氧和血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白，影響組織細(xì)胞供氧而造成內(nèi)窒息，且被認(rèn)為對(duì)人體有很強(qiáng)的致癌性。苯胺類化合物對(duì)環(huán)境的污染一直被人們所關(guān)注，我國(guó)把苯胺類化合物列入環(huán)境中的重點(diǎn)污染物，并制定最高容許排放濃度5mg/L。此類化工廢水治理較為困難，國(guó)內(nèi)研究較少，至今為止絕大多數(shù)采用物理、化學(xué)的方法加以處理，但這些方法處理費(fèi)用偏高，操作要求較為嚴(yán)格，實(shí)際上難以推廣運(yùn)用。因而迫切需要尋找一些行之有效的、費(fèi)用相對(duì)低廉的處理方法。本文以對(duì)硝基苯胺為目標(biāo)污染物，通過(guò)富集培養(yǎng)某化工廠好氧處理池的污泥，獲得了對(duì)該污染物降解效果較好的混合培養(yǎng)微生物。用該微生物作為降解菌源，對(duì)對(duì)硝基苯胺的生物降解特性進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究。
2.實(shí)驗(yàn)材料與方法
2.1菌種來(lái)源
菌種來(lái)自某化工廠廢水處理系統(tǒng)好氧池污泥
2.2試驗(yàn)儀器及設(shè)備
恒溫?fù)u床；7500分光光度計(jì)；Ph計(jì)；高速離心機(jī)
2.3培養(yǎng)液及微量元素
降解菌培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O,430mg/L；KH2PO4·7H2O,170mg/L；MgSO4·7H2O,22.5mg/L；CaCl2,27.5mg/L；NaEDTA,100mg/L；Na2HPO4·7H2O,668mg/L。
基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO4,1000mg/L；Na2HPO4·12H2O,7000mg/L；檸檬酸鐵，40mg/L；CaCl2·2H2O，100mg/L；MgSO4·7H2O,300mg/L；PH，7.35。
YPS培養(yǎng)液：酵母粉10g/L；蛋白胨10g/L；氯化鈉5g/L。
微量元素（TMS）：FeCl3·6H2O；ZnCl2·4H2O；CoCl2·2H2O；Na2MoO4·2H2O；CaCl2·2H2O；CuSO4·5H2O；H3BO4；HCl等。
基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液：每1L無(wú)機(jī)培養(yǎng)液中添加3mL微量元素和1g無(wú)菌酵母粉。
2.4研究?jī)?nèi)容與方法
2.4.1降解菌的分離
2.4.1.1富集培養(yǎng)
菌種馴化過(guò)程在30℃的恒溫室中進(jìn)行。首先取5mL新鮮的活性污泥加入到盛有50mLYPS培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，在120r/min轉(zhuǎn)速下，連續(xù)振蕩培養(yǎng)24h，然后從中取10%培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的YPS培養(yǎng)液中。在相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，從中取5mL作為接種菌液，加入到含20mg/L對(duì)硝基苯胺的基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液中，10天左右培養(yǎng)液原黃顏色褪去。再取10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的含對(duì)硝基苯胺基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液中，兩天后培養(yǎng)液黃顏色也褪去。把此種培養(yǎng)液作為降解試驗(yàn)的接種菌液，菌體的OD值大約1.2左右，降解特性試驗(yàn)中菌體的接種量均為10mL。
2.4.1.2純培養(yǎng)
從降解速率較高的富集培養(yǎng)物中取樣，在含有對(duì)硝基苯胺平板上劃線分離，放置于30℃恒溫室內(nèi)培養(yǎng)數(shù)天，觀察菌落生長(zhǎng)情況，把形成的耐受力強(qiáng)單菌落挑斜面保存（即為純培養(yǎng)物）。
2.4.2對(duì)硝基苯胺降解特性試驗(yàn)
pH值：對(duì)硝基苯胺初始濃度約為50mg/L，調(diào)節(jié)混合培養(yǎng)液初始pH值，置于30℃恒溫室振蕩培養(yǎng)36h后，以初始培養(yǎng)液為空白參比測(cè)定OD值以及對(duì)硝基苯胺去除率，確定混合培養(yǎng)微生物生長(zhǎng)適宜的pH值范圍。
外加碳源：對(duì)硝基苯胺初始濃度約為50mg/L、100mg/L，pH值約為7.5，分別添加0g/L、0.5g/L、1.0g/L葡萄糖條件下，探明微生物能否利用對(duì)硝基苯胺作為生長(zhǎng)的唯一碳源、氮源和能源，以及不同葡萄糖量對(duì)微生物生長(zhǎng)及對(duì)硝基苯胺去除率的影響。
基質(zhì)濃度：對(duì)硝基苯胺初始濃度約為50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，pH值約為7.5，間隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中對(duì)硝基苯胺濃度、pH及OD值的變化。通過(guò)微生物的生長(zhǎng)曲線、基質(zhì)降解曲線等過(guò)程來(lái)分析該混合培養(yǎng)微生物的基本特性。
2.5分析項(xiàng)目和測(cè)定方法
對(duì)硝基苯胺濃度：采用分光光度法，在最大吸收峰（λmax=360nm）測(cè)定其吸光度；旌弦航(jīng)9000r/min高速離心5min，取上清液測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算其濃度。若對(duì)硝基苯胺濃度超過(guò)10mg/L均稀釋后測(cè)定。
菌體濃度OD值：采用分光光度法，混合液充分搖勻后直接在波長(zhǎng)λ=600nm測(cè)定其吸光度。溶液的菌體濃度等于實(shí)際測(cè)定的OD值減去空白值（不接菌液）的OD值。
pH值：混合液充分搖勻后直接用pH計(jì)測(cè)定。
3.結(jié)果與討論
3.1pH值對(duì)降解的影響
混合培養(yǎng)微生物對(duì)硝基苯胺初始濃度約為50mg/L，在不同初始pH值條件下，經(jīng)30℃恒溫振蕩培養(yǎng)36h后，其菌體濃度OD值和對(duì)硝基苯胺去除率關(guān)系。從圖中可以看出微生物生長(zhǎng)適應(yīng)pH值范圍較寬，在初始pH值為6.5～8.5條件下生長(zhǎng)均較好。這與AdrianSaupe、Zeyer、Lauzening等國(guó)外研究者的研究結(jié)果相吻合——能降解硝基苯類化合物的Pseudomonassp.、Comamonastestosteroni、Bacillussp.、Acidovoraxdelafiedii菌屬最適pH值為6.5～8.5，可以說(shuō)pH值也是影響降解速率的重要因子。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)微生物初始pH值為3.2、3.7時(shí)，其菌體OD值均小于0.4，去除率也很低；pH值為3.7時(shí)去除率為19.5%，而pH值為3.2時(shí)幾乎未見(jiàn)有降解。這說(shuō)明該混合培養(yǎng)微生物中對(duì)硝基苯胺降解菌不適宜在較低的pH值下生長(zhǎng)，但仍具有一定的耐酸性。
值得注意是，當(dāng)初始pH值大于8.5，甚至達(dá)到10.2時(shí)，混合液OD值還是比較高，均超過(guò)1.2，但對(duì)硝基苯胺去除率幾乎為零。這是由于混合液中添加了1.0g/L葡萄糖和1.0g/L酵母膏的緣故。葡萄糖作為外加碳源，提供了微生物生長(zhǎng)的電子受體，促進(jìn)了非對(duì)硝基苯胺降解菌的生長(zhǎng)。
3.2不同碳量對(duì)降解的影響
混合微生物能利用對(duì)硝基苯胺作為生長(zhǎng)的唯一氮源，適量的外在碳源對(duì)微生物的生長(zhǎng)有很大的促進(jìn)作用，混合液的菌體濃度隨外在碳源（葡萄糖）添加量的增加而增大。但混合液中不添加葡萄糖時(shí)，即對(duì)硝基苯胺作為微生物生長(zhǎng)的唯一碳源、氮源和能源，菌體濃度明顯小于添加外在碳源的混合液，最終OD值只有0.05。
葡萄糖添加量對(duì)對(duì)硝基苯胺去除率也有影響。當(dāng)?shù)孜飳?duì)硝基苯胺濃度為41mg/L時(shí)，不添加外在碳源，96小時(shí)內(nèi)去除率為34.7%。而添加0.5g/L葡萄糖外在碳源，前24h對(duì)硝基苯胺降解速率要快于添加1.0g/L葡萄糖的培養(yǎng)液，24h之后其降解速率要慢于后者，但最終去除率都能達(dá)到97％左右。從圖4可以看出，當(dāng)?shù)孜飳?duì)硝基苯胺濃度為83mg/L左右時(shí)，葡萄糖的添加量越多，對(duì)硝基苯胺的降解速率越快，在24h之后表現(xiàn)的更為明顯，最終的去除率分別為16.8％、72.2％和96.8％。
從以上的分析可以說(shuō)明對(duì)硝基苯胺作為難降解有機(jī)物，并不是混合微生物新陳代謝理想的碳源。有研究表明，此種難降解化合物在被降解之前，往往需要利用一些簡(jiǎn)單的碳源；旌衔⑸锢贸跫(jí)碳源（葡萄糖）生長(zhǎng)，并產(chǎn)生相應(yīng)的誘導(dǎo)酶，從而使對(duì)硝基苯胺得到降解。
3.3不同底物濃度對(duì)降解的影響
前12小時(shí)內(nèi)4種培養(yǎng)液菌體生長(zhǎng)均達(dá)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，菌體個(gè)數(shù)成對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，但此時(shí)對(duì)硝基苯胺濃度并未急劇下降。這是由于培養(yǎng)液中添加了1.0g/L葡萄糖和1.0g/L酵母粉,在初始階段微生物以葡萄糖和酵母粉中的碳作為初級(jí)碳源，而且酵母粉中含有維生素B2，促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)。對(duì)硝基苯胺去除率隨底物濃度的增加而下降。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)（43.03mg/L），對(duì)硝基苯胺降解速率明顯要高于其它底物濃度較高的培養(yǎng)液。然而當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭龋?3.03mg/L）后，基于高濃度有機(jī)物毒性對(duì)酶的抑制作用，降解速率比較緩慢，降解速率也比較相近。
3.4混合培養(yǎng)與純培養(yǎng)對(duì)硝基苯胺降解效率的比較
混合培養(yǎng)對(duì)硝基苯胺的去除率要明顯高于純培養(yǎng)。純培養(yǎng)對(duì)硝基苯胺的最高去除率只有0.07左右，比混合培養(yǎng)97％的去除率要小很多。有研究表明聚乙烯醇（PVA）的生物降解需要混合菌完成，一般是pseudomonassp.和Alealigenessp.或兩株不同的pseudomonassp.，它們之間靠一種共生關(guān)系來(lái)完成PVA的降解。Murray[10]對(duì)Bacteroidescellulosolvens和Clostridiumsaccharolyticum混合培養(yǎng)分解纖維素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，前者分解纖維素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，前者分解纖維素為后者提供生長(zhǎng)所需碳源，后者又可利用前者產(chǎn)生的有毒中間產(chǎn)物，消除對(duì)前者分解纖維素的反饋抑制。Mori[11]認(rèn)為，ClostridiumThermohydrosulfuriumYM3和C.ThermocellumYM4混合培養(yǎng)降解纖維素效果明顯高于單菌培養(yǎng)，主要原因是兩菌互相提供了對(duì)方所需的生長(zhǎng)因子。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也可以證明，混合菌對(duì)有機(jī)物的去除率要高于單一菌株，但混合菌株之間是以何種關(guān)系促成有機(jī)物的降解有待于進(jìn)一步研究。
3.5對(duì)硝基苯胺降解的動(dòng)力學(xué)分析
從上述3.2的分析中可以看到，適量的外在碳源可以大大提高對(duì)硝基苯胺的去除率。為了解混合培養(yǎng)微生物降解對(duì)硝基苯胺的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，先假設(shè)對(duì)硝基苯胺降解遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。根據(jù)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)公式，對(duì)試驗(yàn)數(shù)值進(jìn)行整理，分別做曲線，并擬合求解反應(yīng)速率常數(shù)K，見(jiàn)表1。
從相關(guān)系數(shù)可以看出，混合培養(yǎng)微生物降解對(duì)硝基苯胺反應(yīng)可以近似用一級(jí)反應(yīng)來(lái)描述。另外，從降解速率常數(shù)K值的大小可以進(jìn)一步說(shuō)明補(bǔ)充碳源對(duì)不同底物濃度以及碳源量在降解對(duì)硝基苯胺過(guò)程中的作用是不一樣的。在低底物濃度（41mg/LNA），補(bǔ)充0.5g/L葡萄糖可以大大提高對(duì)對(duì)硝基苯胺的降解作用，但過(guò)多的外加碳源量（1.0g/LGlu）反而降低了對(duì)硝基苯胺的降解速率。這是由于過(guò)多的葡萄糖對(duì)對(duì)硝基苯胺的降解起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。在高底物濃度（83mg/LNA），隨著外加碳源量的增加，對(duì)硝基苯胺的降解速率也相應(yīng)的增加，但降解速率要慢于低底物濃度的培養(yǎng)液。
表1對(duì)硝基苯胺在不同濃度下的降解速率常數(shù)
Table1ThedegradationratecontantatdifferentinitialconcentrationofNA
項(xiàng)目41mg/LNA83mg/LNA
0g/LGlu0.5g/LGlu1g/LGlu0g/LGlu0.5g/LGlu1g/LGlu
K×103/L(g·h)-1相關(guān)系數(shù)3.50.8601480.912141.40.9071.50.85713.50.985635.50.9082
4.結(jié)論
通過(guò)富集培養(yǎng)某化工廠的活性污泥獲得降解對(duì)硝基苯胺的混合培養(yǎng)微生物。在好氧條件下對(duì)硝基苯胺具有較高的降解速率4.1mg/（L·h）。降解反應(yīng)遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)確定了該混合培養(yǎng)物的適宜生長(zhǎng)條件：pH為6.5～8.5，溫度為30℃左右。該混合培養(yǎng)物能利用對(duì)硝基苯胺作為生長(zhǎng)的唯一碳源、氮源、能源，但降解速率較慢。適量的外加碳源可以大大的提高對(duì)硝基苯胺的降解速率，但在低底物濃度時(shí)過(guò)多的碳量會(huì)對(duì)對(duì)硝基苯胺的降解起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用；旌吓囵B(yǎng)微生物的降解速率要明顯的高于純培養(yǎng)的單一菌種，因此尋找高效好氧降解菌，仍是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)。
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