發(fā)光細菌暗變種檢測環(huán)境樣品致突變性
摘要：在發(fā)光細菌的應(yīng)用過程中人們發(fā)現(xiàn)并分離出了它的自發(fā)暗變種（K變種），如1980年Ulitzue等從鮒魚發(fā)光桿菌P. leiognathifenli分離到自發(fā)暗變種，并根據(jù)化合物使暗變種恢復(fù)發(fā)光的能力檢測其致突變性，證明在各種堿基置換劑和移碼劑存在下，可大大提高暗變種在世代中的回復(fù)突變率。文獻證明DNA合成抑制劑和DNA插入劑也可提高其回復(fù)突變率。該項技術(shù)已被美國Azur公司（原Microbics公司）定名為MutatoxTM方法。
關(guān)鍵字：發(fā)光細菌 檢測 環(huán)境樣品 突變性
顧宗濂于1993年首次在國內(nèi)報道利用自行分離到的明亮發(fā)光桿菌的自發(fā)暗變種T9171菌株，測試五種遺傳毒物的致突變性，指出暗變種對化合物致突變效應(yīng)的靈敏度高于Ames試驗，發(fā)光細菌暗變種試驗可望成為一種簡易靈敏的生物致突變性測試方法。
本文對發(fā)光細菌暗變種的檢測原理、測試方法和應(yīng)用研究作簡要介紹，并與Ames試驗進行比較，以推進暗變種方法在我國環(huán)境監(jiān)測中的研究和應(yīng)用。
1. 檢測原理
對發(fā)光細菌經(jīng)過理化方法誘變處理后，使其失去發(fā)光能力或發(fā)光強度極弱，稱為暗變種（K. variant）。若暗變種接觸致突變物，在世代分裂時可導致突變，恢復(fù)一定程度的發(fā)光能力。利用暗變種恢復(fù)發(fā)光的現(xiàn)象，可對各種遺傳毒物或環(huán)境樣品進行篩選、檢測。這可能是由于致突變物使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使其不能產(chǎn)生或產(chǎn)生無活性的抑制物質(zhì)，也可能使DNA雙鏈發(fā)生構(gòu)象改變，使抑制物質(zhì)不能與之結(jié)合而失去抑制效應(yīng)，總之，真正的回復(fù)突變機理目前還不清楚。
2. 測試方法
AZUR 公司采用費氏弧菌Vibrio fischeri 的暗變種M 169，制成凍干粉于
顧宗濂在研究初期采用暗變種的新鮮培養(yǎng)液，
3. Mutatox與Ames試驗的方法比較
Mutatox與Ames試驗屬于體外致突變性檢測方法，都是細菌法，使用大鼠肝臟提取液S9作為代謝活化因子。Mutatox與Ames試驗相比具有快速、簡便等特點，具體從以下幾點加以討論：
(1) Mutatox試驗中使用的發(fā)光細菌暗變種是從AZUR 公司購買的真空包裝凍干粉，
(2) Mutatox試驗不需要嚴格的無菌條件。一般情況下Mutatox測試不受環(huán)境中存在的非發(fā)光細菌的影響，只有當雜菌的濃度過大（約大于105/mL）時才需要用0.22μm的膜進行過濾。同時，Mutatox測試介質(zhì)含有高濃度鹽、低濃度營養(yǎng)液和一些廣譜性抗菌素，相對高濃度測試菌株的加入，以及測試終點的檢測特點，大大降低了可能進入測試系統(tǒng)的雜菌對測試結(jié)果的影響。Ames試驗需要進行嚴格的無菌操作，對工作人員的微生物實驗技能要求較高。因為雜菌的存在會嚴重影響平皿滲入法計算回變菌落數(shù)。
(3) Mutatox方法不需要繁瑣且昂貴的連續(xù)培養(yǎng)，批量生產(chǎn)的凍干粉保證了其品質(zhì)的穩(wěn)定性，并能減小其遺傳變異。試驗一般只需要24小時即可完成，操作簡便、花費低。Ames試驗一般需要48-72小時完成，要配制多種培養(yǎng)基，所需材料多、費用高、費時較多。
(4)為了使Mutatox方法標準化，已經(jīng)有大量的工作比較了Mutatox方法與Ames試驗對單一化合物和環(huán)境樣品致突變性檢測的靈敏度和準確性。Johnson B.T. 對8種典型致突變前體物的檢測結(jié)果證明，Mutatox方法和Ames試驗在定性和定量兩方面的靈敏度相近，Mutatox方法可成為檢測復(fù)雜環(huán)境中致突變物質(zhì)的一個有效的監(jiān)測手段。謝思琴、顧宗濂等對發(fā)光細菌暗變種T9171的靈敏度進行了研究，結(jié)果充分說明T9171試驗與Ames試驗檢測遺傳毒物所反映的遺傳毒性水平具有較好的一致性。
4．應(yīng)用
近年來，科學工作者已經(jīng)用發(fā)光細菌暗變種檢測出100多種單一化合物的致突變性，同時也用于檢測各種環(huán)境樣品的致突變性。Kwan等用Mutatox方法測試了河水和沉積物的有機提取物的致突變性，同時檢測了其急性和慢性毒性，證明Mutatox是成組試驗（battery of tests）中有用的方法。Békaert等利用Ames和Mutatox試驗、活體兩棲動物微核試驗對被PAHs和重金屬污染的土壤浸出液進行致突變性檢測，通過非過濾樣品和過濾樣品的比較試驗，指出Mutatox試驗中樣品不經(jīng)過0.45μm膜過濾能更準確地檢出顆粒物上吸附的生物活性污染物的致突變性。
此外，Johnson用Mutatox和Microtox方法測定了50多種農(nóng)藥、致突變劑和工業(yè)污染物，Mutatox方法對各種化合物的敏感性與文獻報道的Ames實驗結(jié)果相一致，統(tǒng)計分析結(jié)果表明急性毒性和致突變性之間存在著明顯的相關(guān)性（p<0.05），并利用這兩種方法測試了8個有機沉積提取物。
1993年以來，我國學者利用明亮發(fā)光桿菌的自發(fā)暗變種T9171進行了一些研究工作。首先研究了T9171暗變種對5種已知的致突變劑的回復(fù)突變效應(yīng)，利用所建立的實驗方法檢測了工業(yè)廢渣的致突變效應(yīng)，結(jié)果與Ames試驗結(jié)果的趨勢相似。將暗變種T9171制成凍干粉，采用改進的實驗方法研究了36種有機化合物的致突變效應(yīng)，并與Ames試驗比較，以一致陽性的受試物最低劑量進行相關(guān)分析，在0.01的顯著性水平上兩種方法的吻合率達69%。趙華清等將此方法應(yīng)用于環(huán)境樣品中，檢測了14種環(huán)境水樣和9種化合物的基因毒性，結(jié)果說明加S9能大大提高發(fā)光細菌暗變種的檢測靈敏度。
Mutatox方法在國際上已經(jīng)得到了一定程度的應(yīng)用，但是由于凍干粉價格相對較高，很難在我國推廣。我國學者自行分離出暗變種T9171，并進行了初步的研究，但該法的測定步驟及其判斷標準還有待于進一步完善。隨著簡便、快速、經(jīng)濟的發(fā)光細菌暗變種測試方法的逐步成熟，并與其它化學和生物測試方法聯(lián)合，應(yīng)用前景將會非常廣闊。
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