污染物質(zhì)引起的DNA損傷及其檢測(cè)
摘要: 排入環(huán)境中的污染物質(zhì)能夠?qū)C(jī)體遺傳物質(zhì)DNA造成損傷，這些DNA損傷包括形成DNA加合物、DNA鏈斷裂及堿基置換等,測(cè)定DNA損傷能夠反映遺傳毒性物質(zhì)對(duì)機(jī)體的影響程度。因此，DNA損傷檢測(cè)對(duì)于評(píng)估污染物質(zhì)的行為具有重要的意義。文章重點(diǎn)介紹了目前流行的檢測(cè)DNA損傷的方法，如32P后標(biāo)記技術(shù)、堿性解旋法和彗星測(cè)定法等。由于DNA損傷的類(lèi)型比較多，測(cè)定DNA結(jié)構(gòu)損傷仍存在相當(dāng)多的困難，DNA損傷的檢測(cè)技術(shù)尚須進(jìn)一步完善，靈敏度和專(zhuān)一性需進(jìn)一步提高。
關(guān)鍵詞： 污染物質(zhì) ;DNA損傷 ;檢測(cè) ;遺傳毒性
1 前言
生物標(biāo)志物（Biomarker），是生物體暴露于環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)的變化[1]。這種效應(yīng)可以發(fā)生在生化、細(xì)胞、生理、行為或能量的變化上[2]。生物標(biāo)志物可用來(lái)檢測(cè)和評(píng)估污染物質(zhì)對(duì)環(huán)境質(zhì)量的影響并作出預(yù)警。在分子水平上，通常把酶代謝活性的增減和DNA結(jié)構(gòu)的損傷，作為污染物的生物標(biāo)志物。脫氧核糖核酸（DNA）存在于生物體的細(xì)胞內(nèi)，是遺傳信息的載體。任何DNA分子的異常變化都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生物學(xué)后果[3]，從基因、組織、器官、個(gè)體、種群、群落的不同層次表現(xiàn)其效應(yīng)。因此，DNA損傷作為標(biāo)志物的研究，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。本文對(duì)污染物質(zhì)誘導(dǎo)引起的DNA結(jié)構(gòu)損傷和機(jī)制，及用于測(cè)定DNA損傷的技術(shù)與方法進(jìn)行綜述。
2 DNA結(jié)構(gòu)損傷及其機(jī)制
在細(xì)胞核內(nèi)，DNA分子保持著一種在穩(wěn)態(tài)和非穩(wěn)態(tài)之間的動(dòng)態(tài)平衡。在正常條件下，非穩(wěn)態(tài)只有生理過(guò)程啟動(dòng)時(shí)的暫時(shí)現(xiàn)象（如DNA復(fù)制、分子在細(xì)胞代謝中的隨機(jī)熱碰撞），在這種情況下DNA的損傷很快就被修復(fù)[4]，或變成新的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的一部分（如復(fù)制后修復(fù)），而使機(jī)體保持正常運(yùn)轉(zhuǎn)。
污染物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)后通常會(huì)擾亂有機(jī)體正常細(xì)胞代謝過(guò)程，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而發(fā)生一系列細(xì)胞問(wèn)題。很多化學(xué)物質(zhì)經(jīng)過(guò)體內(nèi)的酶系統(tǒng)活化，產(chǎn)生中間代謝產(chǎn)物，這類(lèi)具有強(qiáng)親電性的代謝物可與脂類(lèi)、蛋白、RNA或DNA的親核中心發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定或不穩(wěn)定的加合物。污染物質(zhì)與DNA結(jié)合就形成DNA加合物（DNA Adducts）。很多研究已經(jīng)證明，多種誘變劑或其活性產(chǎn)物與DNA結(jié)合形成DNA加合物，DNA加合物與基因突變密切相關(guān)，在人類(lèi)腫瘤發(fā)生中起重要作用[5]。例如，黃曲霉毒素Ｂ和苯并芘的強(qiáng)烈致癌作用，就是DNA經(jīng)生物活化成為環(huán)氧化物而導(dǎo)致的。污染物質(zhì)與DNA共價(jià)結(jié)合，所攻擊的堿基和位置有些是專(zhuān)一的，有些則專(zhuān)一程度較低。如AFF僅特異地作用于鳥(niǎo)嘌呤Ｃ-8位，而烷化劑則在中性環(huán)境中幾乎能與核苷酸鏈上的全部氧和氮原子(除了連接在戊糖上的氮以外)產(chǎn)生烷化作用。DNA加合物的形成可能是產(chǎn)生DNA突變的第一階段，以后會(huì)發(fā)生使DNA鏈斷裂、堿基置換和堿基缺失等一系列事件。
很多化合物能夠引起DNA鏈直接斷裂。比如由污染物質(zhì)經(jīng)過(guò)代謝生成的自由基和去堿基位點(diǎn)，能夠引起DNA分子內(nèi)磷酸二酯鍵的斷裂。污染物質(zhì)也能干擾DNA的正常活動(dòng)，如復(fù)制、甲基化和修復(fù)，這些都能夠?qū)е伦儺悾▔A基的增補(bǔ)或缺失）。污染物質(zhì)引起的DNA結(jié)構(gòu)改變及其機(jī)制見(jiàn)下表：
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3 DNA損傷的檢測(cè)
由于環(huán)境問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注，人們?cè)诓粩喟l(fā)展并完善靈敏的技術(shù)來(lái)檢測(cè)化學(xué)物與DNA的作用，從而使加合物的量、甲基化的比例、DNA鏈斷裂(DNA Strand Break)的數(shù)量等成為DNA損傷的重要指標(biāo)。
3.1 DNA加合物及其測(cè)定
大多數(shù)環(huán)境化合物共價(jià)結(jié)合到在生理上起重要作用的受體分子上，對(duì)生物產(chǎn)生負(fù)面影響。有機(jī)磷化合物毒害作用和化學(xué)致癌的過(guò)程，就是因?yàn)樘囟ɑ瘜W(xué)物共價(jià)結(jié)合到分子受體上才發(fā)生的。有些化學(xué)物與蛋白質(zhì)結(jié)合，有些與DNA結(jié)合，那么只要測(cè)定這些產(chǎn)物就能夠鑒定遺傳毒性物質(zhì)的毒害作用及其程度[7]。
目前，測(cè)定DNA加合物的方法有多種，但靈敏性不同，包括熒光光度法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫測(cè)定檢測(cè)（ELISA）和32P后標(biāo)記技術(shù)(32P Postlabeling Technique)等。最主要的測(cè)定方法是32P后標(biāo)記技術(shù)，此方法在環(huán)境監(jiān)測(cè)上得到廣泛的應(yīng)用[8]。32P后標(biāo)記技術(shù)測(cè)定DNA加合物的測(cè)定包括以下步驟：
1）DNA的提取。將組織勻漿分別用蛋白酶K和RNA酶消化去除蛋白質(zhì)和RNA，然后依次用飽和酚、氯仿/異戊醇（體積比24/1）抽提DNA。
2）DNA酶解和標(biāo)記。利用小球菌核酸酶和脾磷酸二酯酶進(jìn)行酶解后，加入T4多核苷酸激酶和γ-32P-ATP進(jìn)行標(biāo)定。
3）TLC薄層層析。將樣品點(diǎn)在ODS TLC(吸附薄層色譜)板上，利用DNA加合物和DNA正常水解物色譜性能的差異,分離加合物和正常核酸。不同的DNA加合物采用PEI TLC(陰離子交換薄層色譜)板分離分辨。
4）以放射自顯影或液閃記數(shù)等方法定量。
此方法的最大優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)能力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣，可檢測(cè)任何化合物與DNA的連接，尤其是可用于環(huán)境中生物樣品的加合物測(cè)定及判斷加合物的毒性，包括純品或混合物是否有潛在的致癌作用。同時(shí)具有極高的靈敏度，可檢測(cè)到1010個(gè)堿基中的1個(gè)DNA加合物。該方法在定性定量研究遺傳毒性物質(zhì)污染方面具有極大的潛力。
3.2 DNA 堿基修飾和其它非加合性結(jié)構(gòu)損傷及其檢測(cè)
污染物質(zhì)除了與DNA形成加合物引起DNA分子改變外，還可以間接引起其它類(lèi)型的損傷。例如苯并芘-DNA加合物，能夠干擾DNA甲基化酶的性質(zhì)，阻礙新合成DNA的甲基化過(guò)程，從而使新形成的DNA甲基化不足。此外，自由基也能夠引起DNA損傷，這些外源物質(zhì)經(jīng)微粒體代謝產(chǎn)生的過(guò)氧基和氫氧基，通過(guò)DNA堿基的氧化直接損傷DNA，尤其是鳥(niǎo)嘌呤（Guanine）。自由基能夠使鳥(niǎo)嘌呤產(chǎn)生8-羥脫氫鳥(niǎo)苷（8-OH-dGUO），或使鳥(niǎo)嘌呤開(kāi)環(huán)形成2，6二氨基-4羥基-5-甲酰氨基嘧啶（FapyGua）。這2種物質(zhì)都可以進(jìn)行定量測(cè)定，以便評(píng)估遺傳毒性物質(zhì)對(duì)DNA的損傷程度[9， 10]。
3.3 DNA鏈斷裂及其檢測(cè)
在細(xì)胞中普遍存在著DNA鏈斷裂，熱能使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生成千上萬(wàn)的去堿基位點(diǎn)，在正常條件下這些位點(diǎn)迅速被修復(fù)，但這種破壞間接導(dǎo)致DNA鏈斷裂（最初是DNA鏈堿基的丟失，而這種損傷的修復(fù)在DNA分子上產(chǎn)生臨時(shí)的縫隙）。離子輻射和自由基也能引起DNA鏈斷裂。
DNA的測(cè)定基于以下原理：在高pH下，使DNA變性，從雙鏈DNA釋放的單鏈DNA的量，與DNA鏈斷裂的數(shù)量成一定比例。應(yīng)該注意，在DNA分子中去堿基位點(diǎn)形成的單鏈DNA斷裂，也能被檢測(cè)出來(lái)。
其原理是，在一定pH和溫度下，DNA分子內(nèi)單股斷裂處發(fā)生鏈分離，在一定的時(shí)間內(nèi)，殘余的雙鏈DNA量與斷裂點(diǎn)的數(shù)量成反比。這是通過(guò)檢查DNA分子的完整性，來(lái)證明化合物對(duì)DNA的作用。具體步驟如下：1)堿解旋。將細(xì)胞在一定溫度的暗環(huán)境中堿性處理一定時(shí)間，細(xì)胞經(jīng)極短時(shí)間超聲處理后(10s)，加入濃度為0.02～0.03mol/Ｌ的堿性溶液，置于
另一種測(cè)定DNA鏈斷裂的分析技術(shù)是凝膠電泳。在堿性條件下，DNA在瓊脂糖凝膠基質(zhì)上電泳，由于遷移率的不同，分子量不同的DNA得到分離。經(jīng)過(guò)溴化乙錠染色，DNA斷裂很容易被測(cè)定出來(lái)。凝膠電泳經(jīng)過(guò)合適的pH控制既可測(cè)定單鏈斷裂，也可以測(cè)定雙鏈斷裂[12，13]。
彗星測(cè)定也稱(chēng)為單細(xì)胞微凝膠電泳技術(shù)(SCG)，用溴化乙錠染色能顯示DNA單鏈斷裂和遇堿去堿基位點(diǎn)。SCG技術(shù)的原理是：首先在細(xì)胞裂解液的作用下破壞細(xì)胞膜、核膜和其它膜結(jié)構(gòu)，這樣細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA及其它成分均可進(jìn)入凝膠并擴(kuò)散到裂解液中,而核DNA因分子量高,且具有嚴(yán)密的超螺旋結(jié)構(gòu)而留在原位。然后用堿處理并在堿性條件下電泳，DNA解螺旋且堿變性為單鏈，若細(xì)胞DNA受損遇堿去堿基位點(diǎn)和單鏈斷裂,則會(huì)出現(xiàn)分子量較小的DNA片段。在電場(chǎng)中，小DNA片段就會(huì)離開(kāi)核DNA在凝膠分子篩中向陽(yáng)極移動(dòng)，形似彗星，故稱(chēng)為彗星實(shí)驗(yàn)。DNA遷移的距離和數(shù)量就可以指示鏈斷裂的數(shù)量[14]。彗星測(cè)定法簡(jiǎn)潔、快速、經(jīng)濟(jì)，在水環(huán)境污染物質(zhì)對(duì)細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)中的應(yīng)用已有很多報(bào)道。
以上是DNA鏈斷裂的幾種檢測(cè)方法。值得注意的是,在細(xì)胞內(nèi)熱能正常的細(xì)胞代謝過(guò)程和暴露于污染物質(zhì),都能引起DNA斷裂。因此如何區(qū)分在正常條件下的鏈斷裂和異常條件下的鏈斷裂成為檢測(cè)關(guān)鍵。解決此問(wèn)題的途徑就是選擇一個(gè)合適的對(duì)照種群來(lái)作比較。理想的對(duì)照種群應(yīng)當(dāng)沒(méi)有經(jīng)受污染化合物的脅迫，并經(jīng)歷與實(shí)驗(yàn)種群一樣的自然環(huán)境。那么，如實(shí)驗(yàn)種群的鏈斷裂數(shù)量高于對(duì)照種群，就表明污染物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)種群造成了損傷。
4 問(wèn)題與展望
4.1作為污染物的生物標(biāo)志物，DNA損傷的檢測(cè)提供了一種手段，用來(lái)定性和定量觀察DNA損傷形成、由損傷帶來(lái)的DNA生物過(guò)程的改變和對(duì)靶組織損害之間的關(guān)系。但目前缺乏了解DNA損傷與相關(guān)種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)水平上效應(yīng)的直接聯(lián)系，因此在這方面需加強(qiáng)研究。
4.2污染物質(zhì)對(duì)DNA所產(chǎn)生的臨時(shí)反應(yīng)可能會(huì)持續(xù)一段時(shí)間，持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短依賴(lài)于有機(jī)體對(duì)損傷DNA的恢復(fù)能力、毒物作用的方式（慢性致毒還是急性致毒）和毒物的劑量。雖然DNA分子結(jié)構(gòu)的干擾不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，但會(huì)引發(fā)其他問(wèn)題，尤其會(huì)干擾DNA修復(fù)的正確性。異常DNA會(huì)帶來(lái)一系列的后果，比如染色體異常、姊妹染色體交換、微核形成和非整數(shù)倍、激活致癌基因、蛋白質(zhì)功能失調(diào)等[6]，這些都與有機(jī)體的表現(xiàn)型有關(guān)，需要建立一套新的技術(shù)與方法來(lái)檢測(cè)污染物質(zhì)對(duì)有機(jī)體的影響。
4.3污染物質(zhì)通常只以很低的濃度出現(xiàn)在環(huán)境中，一旦生物獲得，就會(huì)很快被解毒，因此污染物質(zhì)只能引起DNA少量的被修飾或被損傷。此外，DNA損傷的類(lèi)型也比較多，故測(cè)定DNA的結(jié)構(gòu)損傷仍存在相當(dāng)大的困難。DNA損傷的檢測(cè)技術(shù)尚需進(jìn)一步完善，靈敏度尚需提高，尤其是對(duì)于自由基引起的DNA損傷。
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